全世界超過10%的人口患有慢性腎病（CKD）。糖尿病和高血壓是導(dǎo)致終末期腎?。?/span>ESRD）發(fā)展的主要原因，常與腎小球有關(guān)。高血壓被認(rèn)為會(huì)特異性地?fù)p害足細(xì)胞，足細(xì)胞是腎小球中一種終末分化的上皮細(xì)胞類型，具有較大的細(xì)胞體、延伸突起和足突（FP），貼附于腎小球基底膜（GBM）表面。為了防止腎小球高血壓引起的足細(xì)胞脫離和損傷，了解負(fù)責(zé)的機(jī)械傳感器是必不可少的。研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)的足細(xì)胞具有機(jī)械敏感性，并且機(jī)械應(yīng)力和流動(dòng)誘導(dǎo)的剪切應(yīng)力會(huì)改變它們的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架以及基因表達(dá)。然而，負(fù)責(zé)肌動(dòng)蛋白重組的機(jī)械傳感器仍然未知。

斑聯(lián)蛋白（Zyxin）是一種重要的黏著斑（FA）和肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白，已被描述為在細(xì)胞對(duì)機(jī)械力的反應(yīng)中起重要作用。Zyxin是一種鋅結(jié)合磷蛋白，有一個(gè)N-末端的富含脯氨酸結(jié)構(gòu)域和三個(gè)在其C-末端的一半LIM結(jié)構(gòu)域。據(jù)報(bào)道，Zyxin的N末端結(jié)合輔肌動(dòng)蛋白α-actinin、細(xì)胞骨架效應(yīng)蛋白Ena/VASP及LIM和SH3結(jié)構(gòu)域蛋白1（LASP-1）和拉伸應(yīng)力敏感蛋白p130Cas。特別是，Zyxin的LIM結(jié)構(gòu)域?qū)Ρ┞队趩屋S拉伸的細(xì)胞中的肌動(dòng)蛋白結(jié)合和應(yīng)力纖維定位至關(guān)重要。這可能足以在細(xì)胞遷移過程中產(chǎn)生力誘導(dǎo)的Zyxin積累。

在體內(nèi)，Zyxin被描述為防止高血壓引起的心功能障礙以及發(fā)揮機(jī)械傳感器的功能。最近，德國(guó)格賴夫斯瓦爾德大學(xué)醫(yī)學(xué)院解剖和細(xì)胞生物學(xué)系、海德堡大學(xué)心血管生理學(xué)系及漢堡-埃彭多夫大學(xué)醫(yī)學(xué)中心的研究團(tuán)隊(duì)調(diào)查了Zyxin在機(jī)械拉伸的足細(xì)胞（腎小球高血壓模型）中的作用，描述了Zyxin在體外機(jī)械拉伸期間對(duì)有絲分裂后足細(xì)胞的粘附，以及體內(nèi)維持腎臟過濾是必不可少的。研究成果發(fā)表在Communications Biology期刊題為“Zyxin is important for the stability and function of podocytes, especially during mechanical stretch”。

首先，研究Zyxin在培養(yǎng)的小鼠足細(xì)胞中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Zyxin與黏著斑蛋白以及肌動(dòng)蛋白纖維共定位。

為了確定機(jī)械拉伸是否調(diào)節(jié)Zyxin的表達(dá)，將足細(xì)胞暴露于拉伸應(yīng)力3天（0.5Hz，5%伸長(zhǎng)率），通過免疫熒光染色和qRT-PCR分析Zyxin在拉伸（STR）和未拉伸（US）足細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，由于機(jī)械拉伸，Zyx mRNA水平有輕微但顯著的增加。此外，足細(xì)胞肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架由于機(jī)械拉伸從橫向應(yīng)力纖維重組為徑向應(yīng)力纖維，而且機(jī)械拉伸還誘導(dǎo)了沿肌動(dòng)蛋白絲以及肌動(dòng)蛋白富集中心（ARC）的Zyxin定位增加。

然后研究了Zyxin在暴露于機(jī)械應(yīng)力3天的足細(xì)胞中的作用，生成Zyxin敲除足細(xì)胞系（Zyx-KO），并在相同條件下拉伸Zyx-KO和對(duì)照足細(xì)胞（Ctrl）（圖1 a、b），發(fā)現(xiàn)機(jī)械拉伸后，Zyx-KO足細(xì)胞的細(xì)胞丟失比對(duì)照組更高（圖1 d）。然而，機(jī)械拉伸對(duì)拉伸誘導(dǎo)的F-肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重組和剩余Zyx-KO足細(xì)胞的ARC形成沒有影響（圖1 c）。這表明，Zyxin敲除足細(xì)胞在機(jī)械拉伸后細(xì)胞粘附降低，細(xì)胞丟失增加。

為了研究機(jī)械應(yīng)力下細(xì)胞粘附降低是否是由于黏著斑蛋白的丟失，分析確定了Zyx-KO足細(xì)胞中典型黏著斑（FA）蛋白talin、vinculin和paxillin的表達(dá)水平。與對(duì)照組相比，Zyx-KO足細(xì)胞的vinculin蛋白和mRNA水平顯著降低，但talin和paxillin的表達(dá)不受Zyxin敲除的顯著影響（圖1 e、f）。此外，Zyxin的丟失顯著影響了FAs的大小（圖1 g），vinculin的單個(gè)FA面積大小顯著減小。talin的FA大小保持不變，paxillin陽(yáng)性黏著斑甚至擴(kuò)大。此外，機(jī)械拉伸條件下，vinculin的平均FA大小的降低更為明顯（圖1 h）。

為了找出其他受Zyxin調(diào)控的蛋白，對(duì)Ctrls和Zyx-KO足細(xì)胞克隆進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，Zyx-KO足細(xì)胞中檢測(cè)到71種顯著上調(diào)蛋白和105種下調(diào)蛋白（圖1 i），圖1 k顯示了前25種上調(diào)和下調(diào)的蛋白質(zhì)。值得注意的是，Zyx-KO足細(xì)胞中GO簇被強(qiáng)烈下調(diào)，這與細(xì)胞粘附或肌動(dòng)蛋白絲組織有關(guān)（圖1 j）。

圖1 zyxin KO足細(xì)胞的鑒定及蛋白質(zhì)組學(xué)分析。

接下來，研究了Zyxin對(duì)zyxin-結(jié)合蛋白VASP表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)Zyx-KO足細(xì)胞VASP的蛋白水平較對(duì)照組顯著降低，但其他肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白，如filamin A、α-actinin-1，的表達(dá)不受Zyxin丟失的影響。此外，Zyx-KO足細(xì)胞中，VASP向肌動(dòng)蛋白絲的募集似乎被破壞，這表明VASP以Zyxin依賴性方式被募集到肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維中。蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)一步顯示，Zyx-KO足細(xì)胞中GO簇“肌動(dòng)蛋白絲組織”的顯著調(diào)控，特別是，SIRPA（酪氨酸蛋白磷酸酶非受體型底物1）和IQGAP2（Ras GTPase激活樣蛋白）的蛋白和mRNA水平顯著升高。

蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)表明，細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）蛋白在Zyx-KO足細(xì)胞中顯著下調(diào)（圖2 a）。因此，分析了特異性ECM蛋白的mRNA水平，發(fā)現(xiàn)Nid2、Thbs1和Postn的mRNA水平顯著降低（圖2 b）。通過免疫染色和Western blot分析Zyxin的丟失是否也會(huì)影響纖連蛋白的表達(dá)（圖2 c、d），發(fā)現(xiàn)與對(duì)照相比，Zyx-KO足細(xì)胞中纖連蛋白的蛋白水平顯著降低，特異性纖連蛋白受體整合素α5的表達(dá)也顯著降低，但整合素β1的蛋白質(zhì)水平?jīng)]有變化（圖2 d）。

由于Zyxin缺乏會(huì)顯著降低ECM蛋白的表達(dá)，因此實(shí)驗(yàn)還研究了Zyxin在細(xì)胞鋪展中的作用，將Ctrl和Zyx-KO足細(xì)胞的大小進(jìn)行量化（圖2 e），發(fā)現(xiàn)與對(duì)照相比，Zyx-KO足細(xì)胞在粘附的初始階段細(xì)胞鋪展和細(xì)胞大小都有所減少（圖2 e）。此外，Zyx-KO足細(xì)胞的遷移速度和距離顯著增加（圖2 f）。

根據(jù)Zyx-KO足細(xì)胞中fascin-1蛋白的顯著降低，研究人員推測(cè)絲狀偽足的發(fā)育是由于Zyxin的丟失而改變的，因此分析了Zyx-KO和Ctrl足細(xì)胞的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)除Cdc42外，許多參與絲狀偽足形成的必需蛋白在Zyx-KO足細(xì)胞中顯著下調(diào)，且其中絲狀偽足的數(shù)量和平均長(zhǎng)度均減少。

圖2 Zyx-KO足細(xì)胞顯示細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的表達(dá)降低。

為了弄清楚Zyxin是否在DN患者中也受到調(diào)控，實(shí)驗(yàn)分析了其在患者腎小球中的mRNA表達(dá)，并與微小病變腎?。?/span>MCD）患者和健康者的mRNA水平進(jìn)行了比較。結(jié)果觀察到，與對(duì)照組織相比，DN患者的ZYX mRNA顯著增加，MCD患者的Zyxin表達(dá)沒有顯著變化（圖3 b），對(duì)人類疾病數(shù)據(jù)的分析進(jìn)一步證實(shí)（圖3 c）。此外，在患有DN合并高血壓的患者腎小球足突中，Zyxin和突觸足蛋白（Synaptopodin）的共定位很強(qiáng)（圖3 a）。雖然健康者和MCD患者的Zyxin僅在足細(xì)胞中略有表達(dá)，但在DN患者中高表達(dá)（圖3 a）。此外，在DN患者中，Zyxin表達(dá)特異性增加足細(xì)胞（圖3 d）。此外，數(shù)據(jù)分析表明，在局灶節(jié)段性腎小球硬化（FSGS）患者中，Zyxin表達(dá)與蛋白尿顯著相關(guān)，但與MCD患者和（圖3 g）和血壓（圖3 h）不相關(guān)。

此外，在Zyxin敲除后通過PAS染色分析了腎小球，在6個(gè)月時(shí)檢測(cè)到系膜的擴(kuò)張。腎小球硬化的評(píng)估證實(shí)了Zyx KO小鼠的腎小球損傷。進(jìn)一步確定足突形態(tài)的變化，發(fā)現(xiàn)在Zyx KO小鼠中，與對(duì)照小鼠相比，狹縫隔膜密度顯著降低。通過電子顯微鏡確認(rèn)腎小球的形態(tài)變化，觀察到Zyx KO腎小球中的部分足細(xì)胞足突消失、假性囊腫、系膜細(xì)胞擴(kuò)張和腎小球基底膜增厚。此外，與野生型小鼠相比，雄性Zyx KO小鼠的蛋白尿顯著增加。

圖3 Zyxin在糖尿病腎病和高血壓小鼠中上調(diào)

這項(xiàng)研究強(qiáng)調(diào)了Zyxin對(duì)足細(xì)胞的重要作用。Zyxin的體外丟失降低了vinculin、VASP和基質(zhì)蛋白的表達(dá)；在小鼠中，Zyxin的敲除導(dǎo)致蛋白尿和足細(xì)胞足突的消失。綜上所述，該研究表明Zyxin是一種重要的蛋白質(zhì)，對(duì)體外和體內(nèi)足細(xì)胞的穩(wěn)定性和功能至關(guān)重要，尤其是在機(jī)械拉伸下。

參考文獻(xiàn)：Kliewe F, Siegerist F, Hammer E, Al-Hasani J, Amling TRJ, Hollemann JZE, Schindler M, Drenic V, Simm S, Amann K, Daniel C, Lindenmeyer M, Hecker M, Völker U, Endlich N. Zyxin is important for the stability and function of podocytes, especially during mechanical stretch. Commun Biol. 2024 Apr 11;7(1):446. doi: 10.1038/s42003-024-06125-5. PMID: 38605154; PMCID: PMC11009394.

原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38605154/

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